Histoloji; patoloji laboratuvarında bulunan mikro ölçekte çalışılan dokuların, yapısal detaylarını tanımlamak için kullanılır. Ancak; aynı düzlemle sınırlı oldukları için analizler; iki boyutlu (2D) kalırlar. X-ışını mikro ve nano-bilgisayarlı tomografi (nanoCT) içeren tahribatsız (zarar vermeden) 3D teknolojileri; anatomik yapıları anlamak için geçerliliğini kanıtlamıştır. Çünkü bunlar; isteğe bağlı görüntüleme açılarına ve 3D yapısal detaylara izin verir.
Bununla birlikte, yumuşak dokunun zayıflaması/incelmesi; 3D sanal histoloji alanındaki uygulamalarını da engellemiştir.
Scientific Reports‘da yayınlanan çalışmada; Mark Müller ve Fizik ve Biyomühendislik Bölümü’ndeki meslektaşları; özellikle hücre çekirdeğini hedef alan bir hematein* bazlı X-ışını boyama yöntemi geliştirdi. Ardından bu çalışmayı; bir farenin bütün karaciğer lobunda uyguladılar.
Yeni boyama protokolü; doku mimarisinin nanometre ölçeğinde 3D görselleştirilmesi için yeni geliştirilen, yüksek çözünürlüklü nanoCT sistemini birleştirdi. Sonuçlar; hücre çekirdeğinin mekansal dağılımının yanı sıra; gerçek 3D morfolojisini (yapıbilimsel) de ortaya çıkardı. Teknik; aynı zamanda geleneksel histolojiyle de uyumluydu. Çünkü yumuşak doku numuneli mikroskobik slaytlar; (yumuşak doku örneği) ilave counterstainin** yanı sıra, aynı protokolle boyanabilir. Yöntem, laboratuvarda X-ışını CT cihazları ile birlikte histopatolojide gelecekteki uygulamalarda kullanılabilir.
Histoloji; patoloji laboratuvarında doğru bir mikroanatomik tanı için mevcut altın standarttır. Ancak teknikler ve sonuçlar 2D ile sınırlıdır. Örneğin, bir 3D biyopsi; geleneksel ve modern immünohistokimyasal ve histolojik boyama teknikleriyle genellikle çok ince mikroskopik slaytlar (2-10 µm kalınlıkta dilimler içeren) kullanılarak incelenir. Mikro ve nanoCT, dokunun 3 boyutlu olarak doğru bir şekilde yeniden oluşturulmasını sağlayan güçlü araçlardır. Teknolojideki gelişmeler; büyük partikül hızlandırıcılardan laboratuvar bazlı X-ışını cihazlarına kadar değişen cihazları kullanarak, mevcut 2D konvansiyonel histolojiye kıyasla nispeten, yüksek çözünürlük sağlamıştır.
Teknik gereksinimlerin yanı sıra; fototungstik asit (PTA), iyot potasyum iyodür (IKI), etanol (12E) iyot veya metanol (12M) içindeki iyot gibi X ışınına uygun, boyama maddeleri (kontrast maddeler) de önemlidir. Ancak mevcut boyama maddeleri, kapsam ve etkinlik bakımından şu anda sınırlıdır.Histopatolojide yeni nesil tıbbi teşhis geliştirilirken; bilim insanları, teknikleri optimize etmeyi ve doku mimarisini hücresel seviyeden doku ölçeğine kadar anlamayı hedeflemektedir.
Klinik patolojide ilk tanı sırasında; hücre çekirdeği ve stoplazma önemlidir. Bu nedenle hemen hemen her histolojik numune; çekirdek ve stoplazmayı tanımlamak için standart hematoksilen ve eozin (H&E) (hücrenin bazik kısmı-H-pembe renge ve hücrenin asidik kısmı-E-mavi renge boyanır) protokolü ile boyanır. Ancak hematoksilin*** boyaması için standartlar sabit değildir ve çeşitli doku tipleri ve/veya tedavi öncesi parametreleri nedeniyle protokolde birçok değişken mevcuttur.
Araştırmacılar; yumuşak doku numunelerinde hücre çekirdeğinin doğrudan 3D görselleştirilmesine izin vermek için, özellikle CT için geliştirilmiş hematein bazlı bir boyama protokolü başlattı. X-ışını uygun boyalarıyla birleştirilmiş mikroCT veya nanoCT’nin güçlü potansiyeli, hücresel nano mimaride osteoartrit ve kanser de dahil olmak üzere; hastalığın anlaşılması için doku organizasyonuna dair ileriye dönük görüşler sağlayacaktır.
Boyama protokolü; basit ve yeniden üretilebilir, bütün organ CT boyama için uygundur. 3D görselleştirme ve yumuşak doku örneklerinin derinlemesine, tahribatsız analizi ile bir araya getirilmiştir. Protokolde listelenen boyama maddelerine kolayca erişilebilirken, CT kombine X-ışını uygun protokolü yumuşak doku numunesi analizleri için, daha fazla karmaşıklığa izin verir. Boyama protokolündeki adımlar, laboratuvarda 3D histoloji, gelişimsel ve yapısal biyoloji çalışmaları da dahil olmak üzere; farklı doku tipleri ve farklı uygulamalarda daha fazla optimizasyon gerektirecektir.
X-ışını, 3D sanal histoloji için çekirdeğe özgü boyama etkeni protokolü. Boyama protokolü ve hematein bazlı X ışını boyamanın yumuşak doku ile etkileşimi. (A) Geliştirilen hematein bazlı boyama prosedürü; inkübasyon ve boyama zamanları da dahil olmak üzere bireysel adımları gösterir. Boyama aşaması 1, ağır metal kaynağı olarak kurşun asetat trihidrat kullanılarak gerçekleştirildi. Kurşun asetat trihidrat, damıtılmış su içinde çözüldü ve çalışma çözeltisi (A) (WS (A)) olarak adlandırılır. Boyama aşaması 2, mutlak etanol (WS (B),% 10 (ağırlık / hacim); c = 333 mM) içerisinde bir hematein çözeltisi içermiştir; bu, hematoksilenden türetilmiştir ve WS (A) ‘ya eklenmiştir. (B) Yumuşak doku numunesinde yerinde yapılan pozitif yüklü hematein lead kompleksi (mor), hücre çekirdeğinde bulunan DNA’nın (turuncu) negatif yüklü fosfat omurgası ile etkileşime giriyor. DNA ile kompleks hematinin kompleksinin seçici etkileşimi, fiksasyon sırasında veya lekelenmeden önce yumuşak dokunun asitleştirilmesiyle sağlanır ve hücre çekirdeğinde hematin lead kompleksinin daha yüksek birikmesine izin verir. /Science Reports
* Hematein veya hematin: Laboratuvarda boyamada kullanılan, okside edilmiş bir hematoksilin türevidir.
** Counterstain: Ana boyaya zıt olan ve mikroskop kullanarak boyalı yapının kolayca görülebilmesini sağlayan bir renktir.
*** Hematoksilin: Aynı zamanda doğal siyah 1 veya C.I 75290 olarak da bilinir. Odun ağacının öz odunlarından elde edilen bir bileşiktir. Hematoksilen ve eozin, histolojide en sık kullanılan lekelerden biri olan hematoksilen ve eozin lekesini oluşturur.
